編者：1988 年《實驗動物管理條例》發布實施，在實驗動物工作規范化、法制化管理，保障實驗動物和動物實驗的質量，推動我國科技發展和民生保障等方面發揮了重要作用。特別是在實驗動物標準體系的完善、質量檢測網絡的建設、質量檢測機構能力的提升、質量檢測技術的研究、質量檢測工作的展開等方面，取得了長足的進步與發展。
質量管理是實驗動物管理的核心和切入點。在質量管理方面，標準是依法管理的科學依據，許可證制度是依法管理的主要措施，而質量監測則是標準能夠得以落實、許可證制度得以實施的技術支撐條件保障。建立實驗動物質量監測網絡，依法開展實驗動物質量檢測，為科學監管提供依據。
為此，借“科技資訊”之窗，陸續介紹我國實驗動物質量檢測與評價領域所開展的工作及取得的成果。
一、課題提出的背景與意義
作為科技條件資源，實驗動物是引領生命科學研究和發展的重要支撐保障條件，是生命科學和生物技術創新的基礎。質量標準化是實驗動物得以應用的基本前提，實驗動物質量決定著生命科學等領域研究工作的質量和水平。隨著生命科學和生物技術快速發展，突顯對標準化實驗動物的迫切需求，特別是國家重大疾病防治與新藥創制戰略的實施，以及國際科技交流的不斷增長，實驗動物標準體系的不完善，實驗動物質量標準化水平等問題也逐漸暴露出來。
農用實驗動物牛、羊、鴨、貓、水貂、豬、馬等，國家并沒有相應的標準。標準的缺失造成了我國大量非標準化的實驗用動物應用于教學、科研、生產及藥品檢定，造成了一定的經濟損失和社會危害。因此我國亟需建立相關農用動物實驗動物化的標準及檢測方法。
與國際發達國家相比，國內實驗動物檢測項目仍然落后于發達國家，隨著全球一體化的發展，國內實驗動物質量檢測標準及相應檢測方法已經和國際相關標準存在一定的差距，也使得一些病原微生物因我國標準過低而隨著動物引進帶入國內。因此，結合我國實際情況，完善實驗動物質量檢測標準，相應增加檢測項目，逐步與國際相應標準接軌十分必要。
近年來，隨著病原微生物檢測技術的突飛猛進，目前實驗動物相關檢測方法亟待改進，以提高檢測結果的科學性與準確性。抗原蛋白超靈敏檢測技術，基因芯片檢測技術，多重 PCR/熒光定量 PCR 檢測等技術近幾年獲得了較大的發展，已經應用于檢測領域并有相關試劑盒產品問世，但在實驗動物質量檢測領域并未應用，實驗動物質量檢測效率有待提高，亟需建立多種病原微生物的聯合、快速的檢測方法。
在實驗動物科學發展水平較高的一些國家，商品化、系列化的檢測試劑盒已較為成熟。這些試劑盒的應用， 極大地滿足檢測工作的需要，檢測工作的質量也得到了保證。雖然從國外可以買到部分商品化供應的試劑盒， 但價格昂貴，對我們來講不是解決檢測試劑來源的一個切實可行的途徑。為實施實驗動物許可證管理制度和我國系列實驗動物質量標準，加強實驗動物工作的法制化和科學化管理，促進實驗動物質量提高，充分發揮實驗動物質量檢測在保障實驗動物質量中的作用，研制標準化的檢測試劑盒已成為當務之急。
本項目選擇常用實驗動物、新培育實驗動物、擬實驗動物化農用動物等病原微生物及寄生蟲檢測技術為研究對象，以實驗動物質量檢測方法研究為主題，力爭在 3-5 年內實現我國實驗動物質量檢測試劑的標準化。建立實驗動物新品種的病原微生物和寄生蟲檢測技術,實驗動物新發傳染病病原微生物和寄生蟲檢測技術, 應用新技術改進與完善現有實驗動物傳染病病原微生物和寄生蟲檢測方法，參考國際先進標準建立實驗動物傳染病病原微生物和寄生蟲檢測方法，建立質量檢測新方法評價標準及評價技術平臺，推進實驗動物傳染病病原微生物檢測試劑的注冊與產業化開發。彌補我國現有實驗動物質量檢測試劑種類不多、質量不高、制備不規范、評價不全面、針對性不強等不足，豐富和完善現有實驗動物質量檢測方法，促進實驗動物資源的開發利用，進而推動生命科學領域的研究與發展。
二、課題研究任務的主要內容及任務分工
（一）實驗用動物新品種的病原檢測技術研究與應用
1.實驗用貓病原檢測技術研究與應用：建立 4 種貓易感病毒病原體（泛白細胞減少癥病毒、貓皰疹病毒、貓免疫缺陷病毒、貓杯狀病毒）的 ELISA 或膠體金等檢測方法。建立 2 種貓細菌檢測方法。貓螺桿菌 LAMP 檢測方法，貓巴爾通體熒光定量 PCR 檢測方法。建立貓弓形蟲 ELISA 檢測方法。 在此基礎上，研究制定實驗用貓微生物學和寄生蟲學等級標準（研究稿）及檢測技術規程（研究稿）。
承擔單位分工：吉林大學，中國食品藥品檢定研究院負責檢測方法及標準的建立工作，河北醫科大學負責 檢測方法的實驗驗證工作。
2.實驗用牛病原檢測技術研究與應用：建立 3 種實驗用牛易感病毒病病原體檢測方法，包括瘋牛病 qPMCA 檢測方法，牛傳染性鼻氣管炎病毒熒光 PCR 檢測方法，牛病毒性腹瀉快速 RT-PCR 檢測方法。建立 2 種實驗用牛的易感細菌病病原體檢測方法，包括：牛布魯氏菌 PCR 檢測方法、LAMP 檢測方法，牛結核病雙抗體夾心 ELISA 早期診斷方法。建立實驗用牛人獸共患寄生蟲牛腸道原蟲（隱孢子蟲、賈第蟲等）多重快速鑒別 PCR 檢測方法。在此基礎上，研究制定實驗用牛微生物學和寄生蟲學等級標準（研究稿）及檢測技術規程（研究稿）。
承擔單位分工：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國農業大學、軍事科學科學院野戰輸血研究所、內 蒙古大學和內蒙古農業大學負責相應的病毒及細菌檢測方法及相關標準的制定工作，吉林大學負責寄生蟲檢測方法及相關標準的制定工作。內蒙古大學和內蒙古農業大學負責檢測方法的驗證和田間實驗工作。
3.實驗用羊病原微生物和寄生蟲的檢測技術研究與應用：建立 4 種實驗用羊易感病毒病病原體檢測方法， 包括：羊癢病 qPMCA 檢測方法，藍舌病病毒抗原、抗體 ELISA 檢測方法，山羊痘和綿羊痘通用 PCR 檢測方法及特異性鑒別多重 PCR 檢測方法的建立。建立 1 種實驗用羊的易感細菌病病原體檢測方法。包括：羊布魯氏菌OMP2 基因快速 PCR 檢測方法、BCSP31 基因 LAMP 檢測方法、多重 PCR 檢測方法。建立實驗用羊人獸共患寄生蟲羊腸道原蟲（隱孢子蟲、賈第蟲等）多重快速 PCR 鑒別檢測方法。 在此基礎上，研究制定實驗用羊微生物學和寄生蟲學等級標準（研究稿）及檢測技術規程（研究稿）。
承擔單位分工：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國農業大學、軍事科學科學院野戰輸血研究所、內 蒙古大學和內蒙古農業大學負責相應的病毒及細菌檢測方法及相關標準的制定工作，吉林大學負責寄生蟲檢測方法及相關標準的制定工作。內蒙古大學和內蒙古農業大學負責檢測方法的驗證和田間實驗工作。
4.實驗用 SPF 級鴨病原微生物和寄生蟲的檢測技術研究與應用：建立 3 種 SPF 鴨病毒的病原體檢測方法， 包括：鴨肝炎、鴨瘟病毒、鴨圓環病毒分離鑒定及 PCR（RT-PCR）檢測方法。建立 1 種 SPF 鴨細菌病病原體(李默氏桿菌或大腸桿菌) PCR 檢測方法。建立 1 種 SPF 鴨球蟲鏡檢及 PCR 檢測方法。 在此基礎上，研究制定 SPF 鴨微生物學和寄生蟲學等級標準（研究稿）及檢測技術規程（研究稿）。
承擔單位分工：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所負責相應病毒、細菌檢測方法及相關標準的制定工作， 吉林大學負責寄生蟲檢測方法及相關標準的制定工作。
（二）實驗動物新發傳染病病原的檢測新技術集成創新與應用
1.實驗動物新發傳染病監測新技術研究與應用：小鼠新發傳染病：小鼠 K 病毒、小鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒；地鼠新發傳染病：漢坦病毒、小鼠肝炎病毒、猴病毒 5 和吐蘭 H-a 病毒；犬傳染病：狂犬病病毒、犬細小病毒、偽狂犬病毒、犬巴爾通體；猴新發傳染病：猴泡沫病毒。
承擔單位分工：中國食品藥品檢定研究院負責小鼠、地鼠新發傳染病，猴泡沫病毒檢測方法建立，中國農 業科學院哈爾濱獸醫研究所負責犬傳染病檢測方法及標準的建立工作。
2.檢測新技術集成創新與應用：分別建立猴 B 病毒、狂犬病病毒超靈敏抗原蛋白金納米探針檢測方法；建立小鼠病毒和細菌多重 PCR 檢測方法；針對兔出血癥病毒、犬細小病毒、犬瘟熱病毒和傳染性犬肝炎病毒構建假病毒表達系統；實驗動物寄生蟲診斷技術改進與完善，猴結核病檢測技術改進與完善。
承擔單位分工：軍事科學科學院野戰輸血研究所負責超靈敏抗原蛋白金納米探針檢測方法建立，河北醫科大學負責小鼠病毒細菌多重 PCR 檢測方法建立，中國食品藥品檢定研究院負責實驗動物中和抗體檢測技術建立，吉林大學負責實驗動物寄生蟲診斷技術改進與完善，中國農業大學負責猴結核病檢測技術改進與完善。
（三）實驗動物疫病病原診斷試劑產業化關鍵技術開發與應用
1.新產品臨床申報和注冊：完成 4 種 SPF 雞疫病病原/抗體檢測試劑盒開發，并完成其中 2 種新產品臨床申報和注冊。2.新開發試劑盒產業化。
承擔承擔單位分工：動物用生物制品國家工程研究中心負責新檢測試劑臨床申報和注冊工作，同時項目各 參加單位研發的成熟產品優先通過工程中心進行產業化開發。
三、課題研究要解決的關鍵技術難點
（一）實驗用動物合格的陰性與陽性血清對照采集
雖然貓、牛、羊、鴨等已被用于科學實驗，但國內并未建立標準化的實驗用動物群體，因此，對這些動物所攜帶的病原微生物并不清楚，部分動物易感病原微生物對其自身危害小，但隱性攜帶率較高，陰性血清樣本的獲得較困難。篩選病原微生物陰性動物也是本項目的工作難點之一。同時，還應區分動物的自然感染與免疫后抗體升高的情況，從而獲得合格的陰性與陽性血清對照，這是建立實驗用動物病原微生物血清學檢測的基礎。
（二）檢測用抗體特異性和親和力
獲得病原微生物高特異性和親和力的病毒單抗是保證 ELISA 免疫學檢測特異性和敏感性的關鍵，可通過篩選來獲得符合檢測標準的單抗，同時具備高特異性和效價的單抗可用于相應病原微生物的檢測。
（三）引物及熒光探針特異性和敏感性
核酸檢測探針以及 PCR 引物均是檢測特異性和敏感性的關鍵因素，多重 PCR/熒光定量 PCR 反應體系較為復雜，在生物條形碼檢測技術研究中，除了要求具備高特異性和親和力的單抗外，條形碼 DNA 的熒光定量 PCR 檢測也關系到檢測的準確性。可利用生物信息學方法等設計和篩選核酸探針和 PCR 引物，優化實驗設計以確保檢測的特異性和敏感性。
（四）實驗動物病原微生物檢測試劑的注冊與產業化
實驗動物病原微生物檢測試劑的開發，從技術層面分析，對所有的項目參加單位都不困難，但是將檢測方法最終開發成商品化的檢測試劑，需要有較長的過程。新獸藥證書是檢測試劑產品孵化、轉化的必要條件，本項目吸收了動物用生物制品國家工程研究中心并主要承擔實驗動物疫病病原檢測試劑產業化開發工作，借助其動物疫病檢測制品 GMP 生產線及具有經驗豐富經驗的新獸藥注冊團隊，快速推進新獸藥的申報，全面提升項目成果轉化、孵化能力，為項目成果的推廣應用提供必要的保障，也為今后實驗動物病原微生物檢測試劑注冊與產業化工作起到示范作用。
（五）實驗用動物病原微生物標準毒株與菌種
建立實驗用貓、牛、羊、鴨病原微生物檢測方法，首先需要培養純化標準毒株或菌種，在本研究需要建立的病原微生物檢測技術中，絕大多數病原微生物，國內都已經分離了該毒的標準毒株，但貓的部分病毒病，國內并未分離出標準毒株，在前期研究工作中，項目組從 ATCC 引進了部分標準毒株，并進行了擴大培養。由于病毒存在較大的變異性，因此，在建立檢測方法時，還需要將引進的標準毒株與國內分離的野毒株進行比較， 確保檢測方法的準確性，特別是在建立 PCR 等基因水平檢測方法時，應盡可能選取病毒 N 蛋白等保守序列作為檢測目的片段，以保證檢測結果的準確性。
（六）實驗用動物病原微生物檢測中組織分布豐度的確定
實驗用貓、牛、羊、鴨篩選出合適的病原學檢測方法也多有不同，每種重大疫病在動物體內的感染發病機制不盡相同，特別是新發感染性疾病病原，面臨的第一個問題是疫病發生模式，不同疫病病原在動物體內不同組織分布豐度（組織嗜性）不同，因此同一來源樣品（如肝臟樣品或血清樣品）針對多種疫病病原檢測的敏感性不盡相同，建立多種重大疫病病原學聯合鑒別檢測方法時需確定合適采樣部位。
（七）生物安全問題
本項目所涉及的牛海綿狀腦病、羊癢病、藍舌病等為國家規定的一類動物疫病，需要在動物生物安全三級以上實驗室開展相關研究工作，申請單位雖都已經具備相應實驗室，但在研究工作中仍需避免病原微生物的泄露，同時，應加強對實驗室及參與研究工作的研究生進行培訓，嚴防病原微生物對實驗人員產生危害。
四、課題研究取得的成果
課題組經過三年的聯合攻關，緊緊圍繞實驗用動物病原分子生物學快速檢測新技術研究與應用這一領域開展了深入系統的研究，主要對實驗用動物新品種的病原檢測技術研究與應用、實驗動物新發傳染病病原的檢測新技術集成創新與應用、實驗動物疫病病原診斷試劑產業化關鍵技術開發與應用方面開展研究工作。
（一）實驗用動物新品種的病原檢測技術研究與應用
建立了貓皰疹病毒Ⅰ型 PCR 檢測方法、抗體 ELISA 檢測方法；貓皰疹病毒Ⅰ型抗體 ELISA 檢測方法的；貓細小病毒 PCR 檢測方法的建立；貓細小病毒和貓皰疹病毒 I 型熒光定量 PCR 檢測技術；貓細小病毒和貓皰疹病毒 I 型環介導等溫擴增檢測技術；貓杯狀病毒膠體金及 ELISA 檢測試紙條；貓沙門氏菌的分離鑒定及 PCR 檢測技術；貓螺桿菌 LAMP 檢測方法；貓嗜肺巴斯德桿菌的分離鑒定及 PCR 檢測技術；貓巴爾通體實時熒光定量PCR 方法檢測方法；貓弓形蟲間接 ELISA 檢測方法；貓弓形蟲 Dot-ELISA 檢測方法。實驗用貓共計建立了 8 種病原體的 16 種檢測方法。所建立的檢測方法靈敏、特異、重復性好。
建立了實驗用貓病原微生物和寄生蟲質量控制地方標準，完善了實驗用貓標準化體系。
建立了實驗用牛、羊布魯氏菌 PCR 和 LAMP 檢測方法；實驗用牛、羊布魯氏菌膠體金檢測試紙條；牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒實時熒光定量 PCR 方法；羊傳染性膿皰實時熒光定量 PCR 方法；牛傳染性鼻氣管炎病毒雙重基因 PCR 檢測方法；牛支原體 PCR 檢測方法；實驗用牛的瘋牛病、羊的羊癢病 qPMCA 技術檢測方法；牛病毒性腹瀉抗原、抗體 ELISA 檢測方法；牛結核病雙抗體夾心 ELISA 早期診斷方法；山羊痘和綿羊痘 PCR 檢測技術； 山羊痘和綿羊痘病毒 qPCR 檢測方法；羊藍舌病病毒抗原、抗體 ELISA 檢測方法；實驗用牛十二指腸賈第蟲、微小隱孢子蟲與安氏微小隱孢子蟲三重 PCR 檢測方法；實驗用羊賈第蟲與隱孢子蟲雙重 PCR 檢測方法。實驗用牛共計建立了 17 種病原的 18 種檢測方法。所建立的檢測方法靈敏、特異、重復性好。
建立了實驗用牛、羊的病原微生物和寄生蟲質量控制地方標準，完善了實驗用牛、羊標準化體系。
建立了實驗用 SPF 級鴨鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒病原分離鑒定方法；鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒二重 PCR 檢測方法；鴨圓環病毒 PCR 檢測方法的建立；禽致病性大腸桿菌多重 PCR 檢測方法；鴨球蟲 PCR 檢測方法。實驗用SPF 鴨共計 5 種病原 6 種檢測方法。所建立的檢測方法靈敏、特異、重復性好。
建立了實驗用 SPF 級鴨的病原微生物和寄生蟲質量控制地方標準，完善了實驗用 SPF 級鴨標準化體系。
（二）實驗動物新發傳染病病原的檢測新技術集成創新與應用
建立了小鼠 k 病毒 PCR 檢測方法；猴泡沫病毒（SFV）RT-nestPCR 檢測方法；猴泡沫病毒血清學檢測方法； 猴副流感病毒 PCR 檢測方法；大、小鼠多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體和肺炎克雷伯桿菌實驗動物病原體多重 PCR 檢測方法；小鼠金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌和肺支原體多重PCR 檢測方法；大鼠細小病毒 H-1 株 PCR 檢測方法；大鼠冠狀病毒、仙臺病毒的多重 PCR 檢測方法。共計建立了 15 種病原的 8 種單項或多重檢測方法。
建立了猴 B 病毒、狂犬病病毒的超靈敏抗原蛋白金納米探針檢測技術；猴 B 病毒和人皰疹病毒鑒定技術； 小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR 檢測方法；狂犬病病毒 RT-PCR 和熒光定量 PCR 檢測方法；犬細小病毒 PCR 及熒光定量檢測方法；犬偽狂犬病毒 PCR 及熒光定量檢測方法；犬嗜血巴爾通體 PCR 及熒光定量檢測方法；犬瘟熱病毒（CDV）假病毒系統；犬細小病毒（CPV）假病毒；犬腺病毒 2 型病毒假病毒；兔出血癥病毒假病毒；鼠毛滴蟲巢式 PCR 檢測方法；兔艾美爾球蟲巢式 PCR 檢測方法。共建立了 13 種病原的 19 種檢測新技術。
共計建立了 15 種病原的 8 種單項或多重檢測方法。共建立了 13 種病原的 19 種檢測新技術。
以上所建立的檢測方法靈敏、特異、重復性好。
（三）實驗動物疫病病原診斷試劑產業化關鍵技術開發與應用
完成禽白血病群特異性抗原 ELISA 檢測試劑盒；雞傳染性法氏囊病病毒 ELISA 抗體檢測試劑盒；雞傳染性法氏囊病病毒瓊脂擴散抗原、及陰陽性血清；禽白血病病毒群特異抗原檢測試紙條的產業化開發。新開發雞傳染性支氣管炎病毒 ELISA 抗體檢測試劑盒 1 項，預計后續也將申報新獸藥臨床試驗。
課題執行過程中，共申請國家發明專利 10 件，授權 4 件；獲新獸藥證書 2 項；發表論文 54 篇，其中SCI 收錄文章 20 篇；制定并頒布實驗用貓微生物、寄生蟲吉林省地方標準 2 項；培養碩士研究生 16 名、博士研究生 5 名、博士后 2 名；完成實驗動物從業人員教材 2 部，組織全國實驗動物質量檢測技術培訓 2 次，培訓相關檢測人員 150 人次。
最終完成了任務書中規定的各項研究內容和考核指標。五、快檢技術在我國實驗動物病原學檢測中應用的展望實驗動物是引領生命科學研究和發展的重要支撐保障條件，是生命科學和生物技術創新的基礎。質量標準化是實驗動物得以應用的基本前提，實驗動物質量決定著生命科學等領域研究工作的質量和水平。雖然經過課題組 3 年不懈努力，建立了一批實驗動物質量檢測方法新方法，新技術，新試劑，但是距離我國目前實驗動物質量檢測的需要仍有不小的差距。
（一）實驗用動物方面還有很長的路要走
針對實驗用動物新品種質量控制方面本課題由于不斷的前期組合，包含了 4 個新的實驗用動物新品種（貓， 牛，羊，鴨），雖然各個單位在不同的領域存在各自的優勢，但是由于各個新品種的研究基礎不同，實驗動物標準化程度不同，群體規模也不同，本課題雖然很好的整合了各個參加單位的優勢力量，集中攻關，但研究內容過于繁雜，難免會造成重此輕彼的情況，各個物種進度很難協調一致。未來科技主管部門在以后的課題頂層設計過程中，應突出單一物種，逐個重點攻關，這樣更能高效的解決我國實驗動物標準化所面對的問題。
（二）檢測方法標準化程度不高，推廣應用時間不足
各個課題組建立的試劑盒和檢測試劑的制備以基本完成，部分專利也進入了申報階段，部分試劑盒也進入報批階段。但是試劑盒和檢測方法的推廣應用未的到充分的開發，相關檢測標準的制定和頒布略顯落后。各個課題承擔單位應進一步對所建立的試劑盒及檢測方法進行標準化開發，進一步制定相應的檢測標準，將所建立的檢測方法進行充分的推廣應用實踐，更好的為科研生產服務。
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