乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，據(jù)估計，在較發(fā)達地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率為74.1%，病死率為14.9%，是繼肺癌之后的第二大常見惡性腫瘤和第五大致死疾病。盡管現(xiàn)在的醫(yī)療水平提高了乳腺癌的檢出率及治療效果，但是仍然有部分患者不能從中獲益，其主要原因是乳腺癌發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠端轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)是機體重要的外周免疫器官，在免疫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，當細菌或病毒入侵人體時，淋巴結(jié)能夠抵抗及清除外來異物，減少機體出現(xiàn)感染性疾病的風險。然而，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞能夠進入淋巴管再通過淋巴液遷移到引流淋巴結(jié)中，并且在引流淋巴結(jié)中增殖，使引流淋巴結(jié)發(fā)生病變，甚至還能從引流淋巴結(jié)中逃逸擴散到其他器官。臨床上，淋巴結(jié)的狀態(tài)作為分期預(yù)后因素的診斷價值已被廣泛重視，并且對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否以及轉(zhuǎn)移程度的評價將決定患者的后續(xù)治療。因此在腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，淋巴結(jié)在抗腫瘤免疫中發(fā)揮的作用以及在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后如何對患者進行精準治療仍需進一步研究。
為了對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制進行深入研究，目前急需建立穩(wěn)定成熟的動物模型，重現(xiàn)臨床上乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，以期后續(xù)開展腫瘤學(xué)相關(guān)基礎(chǔ)研究解決臨床上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這一實際難題。目前針對建立腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的動物模型主要有舌下接種法、腳掌接種法、睪丸內(nèi)接種法、骨髓內(nèi)接種法、背部接種法及耳部接種法等，基于其使用的實驗動物的多樣性及實驗操作的復(fù)雜性和穩(wěn)定性，期望通過總結(jié)并優(yōu)化實驗技術(shù)，對小鼠的不同部位進行荷瘤建立不同的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，并通過操作可行性、腫瘤生長速度、淋巴結(jié)病理檢測及小鼠生存等綜合評價不同建模方式的優(yōu)劣性，從而篩選出最穩(wěn)定可靠的動物模型，為乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究奠定基礎(chǔ)，進而為臨床準確評估患者風險和預(yù)后提供參考。
建模方法：
PyMT小鼠自發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型
MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型是通過植入PyMT基因到乳腺特異性啟動子腺病毒（MMTV）的表達載體中建立的。乳腺特異性啟動子的作用使得PyMT基因在小鼠乳腺組織中高表達，從而使小鼠出現(xiàn)乳腺腫瘤的表型。利用該小鼠自發(fā)乳腺癌的特性來觀察其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律。通過對病理切片進行分析后發(fā)現(xiàn)該淋巴結(jié)形成了明顯的巢狀腫瘤，結(jié)構(gòu)破壞明顯，濾泡數(shù)量減少，髓竇形態(tài)明顯改變，可以看到淋巴細胞與腫瘤細胞形成了明顯的分界線。結(jié)果提示MMTV-PyMT小鼠發(fā)生了腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為100%，成瘤率也為100%，MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有自發(fā)性轉(zhuǎn)移、可重復(fù)性和接近病理狀態(tài)的特點，提示其是一個理想的乳腺癌淋巴結(jié)自發(fā)轉(zhuǎn)移研究模型。
腹股溝淋巴結(jié)-對側(cè)淋巴結(jié)型
將BALB/c小鼠后肢腹部和腿部備毛后，對小鼠進行麻醉處理，使用無菌剪刀和鑷子在其腹股溝處剪開約1 cm的小口，取4T1細胞懸液5 μL，共計5×105個細胞，使用一次性無菌胰島素注射針將細胞懸液接種于小鼠腹股溝處淋巴結(jié)中。在細胞懸液進入淋巴結(jié)后，可觀察到淋巴結(jié)明顯凸起，以此確定腫瘤細胞懸液在小鼠淋巴結(jié)內(nèi)注射成功。通過對病理切片分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)內(nèi)部組織已經(jīng)壞死，并且形成較多空泡，淋巴結(jié)中存在大量的細胞核碎片；從細胞核形態(tài)上判讀，應(yīng)是腫瘤細胞來源，說明此時該模型已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但由于取材時間太晚，腫瘤組織已經(jīng)破壞，未能觀察到界限清楚的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，此時的淋巴結(jié)已經(jīng)隨著腫瘤細胞的侵襲發(fā)展為淋巴瘤。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)該荷瘤模型的操作方法難度較大，荷瘤成功率僅為50%。因此，該模型的構(gòu)建對操作者技術(shù)要求較高，重復(fù)性較低，易操作失誤形成皮下瘤，不能成功建立模型。
腿部-腹股溝淋巴結(jié)模型
取4T1細胞懸液100 μL，含5×105個細胞，使用一次性無菌胰島素注射針皮下接種于BALB/c小鼠左后肢大腿處。通過對病理切片分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)已經(jīng)被腫瘤細胞侵襲形成了腫瘤亮區(qū)。內(nèi)部細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞大小、形態(tài)差異大，沒有形成腺體樣結(jié)構(gòu)，但明顯不同于正常的淋巴細胞。對病理切片進一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤細胞的侵襲在淋巴結(jié)內(nèi)形成了2個轉(zhuǎn)移灶，如圖3B中黑色實線圈畫部分所示。同時通過對比前哨淋巴結(jié)（SLN）和對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）質(zhì)量發(fā)現(xiàn)引流淋巴結(jié)的質(zhì)量顯著增加。說明小鼠后肢皮下荷瘤26 d后腫瘤細胞會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，重塑淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)和細胞組成，最終形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。同時該模型操作簡單，成瘤率為100%，重復(fù)性好，但發(fā)生轉(zhuǎn)移的時間較長，不利于后續(xù)實驗的進行。
后腳掌-腘窩淋巴結(jié)模型
取4T1細胞懸液50 μL，含5×105個細胞，使用一次性無菌胰島素注射針皮下接種于BALB/c小鼠左后肢腳掌。結(jié)果顯示在腘窩處的淋巴結(jié)中出現(xiàn)了2處成片的腫瘤亮區(qū)，說明腫瘤細胞在淋巴結(jié)內(nèi)形成了2處轉(zhuǎn)移灶。該部位的細胞形態(tài)不規(guī)則，說明轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞形態(tài)差異大，雖然沒有形成腺體樣結(jié)構(gòu)，但細胞表面成泡狀，與正常淋巴細胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)完全不同。同時發(fā)現(xiàn)前哨淋巴結(jié)（SLN）質(zhì)量較對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）質(zhì)量顯著增加。這也證明通過腳掌荷瘤建立向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小鼠模型是可行的。
舌下-頸內(nèi)靜脈肩胛舌骨肌淋巴結(jié)模型
用鑷子將麻醉后的BALB/c小鼠舌頭固定，取4T1細胞懸液50 μL，含5×105個細胞，使用一次性無菌胰島素注射針接種于BALB/c小鼠舌左緣黏膜下。根據(jù)病理切片的結(jié)果顯示，小鼠淋巴結(jié)正常形態(tài)存在，無腫瘤細胞侵襲。同時荷瘤小鼠的前哨淋巴結(jié)（SLN）與正常小鼠淋巴結(jié)（Control）質(zhì)量無明顯變化。該荷瘤模型成瘤后易引起小鼠進食困難，從而導(dǎo)致小鼠消瘦，在荷瘤的第9天造成小鼠死亡，存活時間短不利于后續(xù)其他實驗的進行。
骨髓內(nèi)-腹股溝淋巴結(jié)模型
取 4T1細胞懸液8 μL，含5×105個細胞，使用一次性無菌胰島素注射針接種于麻醉后的BALB/c小鼠后肢腿脛骨中。結(jié)果顯示小鼠腹股溝淋巴結(jié)未發(fā)生變化，其結(jié)構(gòu)完整，濾泡分布均勻。前哨淋巴結(jié)（SLN）與對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）質(zhì)量無明顯變化，說明此種方法在構(gòu)建淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移小鼠模型上不易成功。該種方法的成瘤率為70%，較其他荷瘤方式成瘤率低。
右上背皮-腋窩淋巴結(jié)模型
取4T1細胞懸液100 μL，含5×105個細胞，使用一次性無菌胰島素注射針皮下接種于BALB/c小鼠右上背皮下。結(jié)果顯示小鼠腋窩處淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，淋巴細胞未發(fā)生變化，同時前哨淋巴結(jié)（SLN）的質(zhì)量與對側(cè)淋巴結(jié)（CLN）相比未發(fā)生顯著變化。此荷瘤方式簡單，成瘤率可達100%，但腫瘤細胞向腋窩淋巴結(jié)的侵襲較緩慢，在荷瘤后17 d依然未見淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)、形態(tài)發(fā)生改變，細胞間質(zhì)也未見明顯變化。
乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命健康，2022年美國新增287 850例侵襲性乳腺癌，其中因乳腺癌而死亡的患者約43 250例。乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移與否決定了患者的治療方法及預(yù)后情況，但目前對于乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制尚未明確，而乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位便是腋窩淋巴結(jié)。為深入了解乳腺癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移機制，目前急需建立穩(wěn)定、高效、易重復(fù)的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。
腫瘤轉(zhuǎn)移模型主要包括自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型、移植性腫瘤轉(zhuǎn)移模型和誘發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型。其中誘發(fā)性轉(zhuǎn)移模型的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移率較低；移植性腫瘤轉(zhuǎn)移模型雖然發(fā)生轉(zhuǎn)移率高、方法簡單，但是其對手術(shù)無菌操作要求嚴格且成瘤周期較長，更重要的是個體差異較大，不適用于所有的實驗動物。因此，在本實驗中主要選擇了自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型進行研究。在所采用的7種荷瘤模型中，PyMT小鼠自發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為100%,可形成巢樣乳腺組織結(jié)構(gòu)，同時其自發(fā)成瘤導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床患者的現(xiàn)象更加吻合，直接選用PyMT小鼠就能滿足實驗要求，無需其他實驗操作，但選擇該模型進行研究時耗費的成本遠高于其他自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型，同時該模型用于研究腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時腫瘤負荷較大，且可能形成多個腫瘤，不利于后續(xù)相關(guān)實驗的進行。
Source: 陸軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報. 2024, 46 （16），乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動物模型的建立及評價，DOI: 10.16016/j.2097-0927.202312031
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