定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。
單點突變原理 單點突變的原理是從常規(guī)E.coli中經(jīng)純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提得到質(zhì)粒。設計一對包含突變位點的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”，(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經(jīng)過反復加熱褪火延伸的循環(huán)，這個反應區(qū)別于滾環(huán)擴增，不會形成多個串聯(lián)拷貝。)正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎（DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，即可得到突變質(zhì)粒的克隆。
多點突變原理 多點突變的原理是準備多個帶突變的引物（同方向，對同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個）都結合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個引物就停止，各片斷經(jīng)連接成環(huán)，和單鏈模版組成雜和環(huán)，Dpn I消化雙鏈模版，也消化雜和環(huán)中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環(huán)（mutant ssDNA），得以轉(zhuǎn)化E.coli，形成雙鏈質(zhì)粒。資料表明，引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點突變的質(zhì)粒，以引入3個定點突變?yōu)槔褪怯?0% 左右的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒是帶有1-2個不同定點突變的質(zhì)粒（因為存在1-2個引物結合模版延伸形成單鏈環(huán)的可能）。
定點突變應用
（1）研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結構、改造酶的不同活性或者動力學特性；
（2）改造啟動子或者DNA作用元件；
（3）提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結構，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。
17312606166