siRNA是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。siRNA 是siRISC的主要成員，激發與之互補的目標mRNA的沉默。越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs）來抑制特定的哺乳動物基因表達。siRNA 是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的 mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。
siRNA化學合成
盡管化學合成是最貴的方法，但是卻是最方便的一種方法。其主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。
最適用于：已經找到最有效的siRNA 的情況下，需要大量siRNA 進行研究；
不適用于：篩選siRNA 等長時間的研究，主要原因是價格因素。
siRNA表達載體
多數的siRNA 表達載體依賴3種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾siRNA 在哺乳動物細胞中的表達。這3類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴增，這個優點足以彌補所有缺陷，特別是當載體在實驗中確實有效的時候。毫無疑問，siRNA 表達載體的優點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。即使是對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選，也有助于富集帶質粒的細胞。這也可以幫助解決一些難轉染的細胞由于轉染效率低造成的問題。
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