TEL:17312606166（魏經(jīng)理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
摘要：聽力障礙是糖尿病的并發(fā)癥之一； 然而，關(guān)于它的治療研究很少。 在這項研究中，我們研究了α-硫辛酸（ALA）對糖尿病轉(zhuǎn)基因斑馬魚聽力損失的保護作用，并證實了ALA保護高血糖引起的毛細胞（HCs）損失。數(shù)據(jù)表明，ALA對糖尿病斑馬魚的HCs損傷具有保護作用。
關(guān)鍵詞：糖尿病 胰腺β細胞 毛細胞 α-硫辛酸 斑馬魚
簡介：以高血糖為特征的糖尿病（DM）會導致多種并發(fā)癥，包括聽力損失、神經(jīng)病變、心肌病和腎病。糖尿病性聽力損失是一種常見的并發(fā)癥，類似于周圍神經(jīng)病變，其特征是耳蝸結(jié)構(gòu)的變化和毛細胞 (HC) 的損失，這些都是由內(nèi)耳脈管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的高血糖損傷引起的。此外，高血糖可通過葡萄糖毒性誘導的細胞內(nèi)應激直接導致 HC 損失，因為 HCs 使用葡萄糖作為能量來源，并且葡萄糖由幾種葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 (GLUT) 轉(zhuǎn)運，例如 GLUT3 和 GLUT10； 葡萄糖是機械轉(zhuǎn)導和 ATP 合成所必需的。然而，聽力損失作為糖尿病的一種并發(fā)癥，在臨床上卻知之甚少，而且目前還沒有針對這種情況的具體治療方法。α-硫辛酸（ALA），也稱為硫辛酸，是糖尿病神經(jīng)病變的治療方法之一。它被認為是一種有效的抗氧化劑，可以作為糖尿病患者聽力損傷的潛在治療方法。一些研究表明，ALA對耳毒性具有保護和治療作用。我們假設(shè) 在糖尿病條件下ALA 可以保護 HCs 免受損害。為了驗證這一假設(shè)，我們利用化學基因消融術(shù)產(chǎn)生了HCs高血糖丟失的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，并檢測了ALA對HCs的保護作用。本研究使用野生型（AB株）和Tg（ins:nfsB-mCherry）系。在單細胞期將Ins:nfsB-mCherry質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射到野生型胚胎中。使用受精后2-5天（dpf）斑馬魚cDNA和根據(jù)GenBank序列設(shè)計的PCR引物擴增ins cDNA。將擴增的cDNA克隆到pGEM-T easy載體中。用SP6 RNA 聚合酶合成了反義RNA探針。如前所述，使用ins探針對斑馬魚胚胎進行原位雜交。
化學處理和TUNEL分析：為了測試胰腺β細胞消融的效率，斑馬魚幼蟲與甲硝唑共孵育2-4 dpf。為了評估ALA的效果，在指定時期內(nèi)用MTZ和ALA孵育斑馬魚幼蟲。為了檢測胰腺 β 細胞的死亡，胚胎用 4% 多聚甲醛固定過夜，用 PBST（含 0.1% Tween-20 的 1×PBS）沖洗，用 20 μg/mL 蛋白酶 K 處理，再次用 PBST 沖洗，然后 與 TUNEL 溶液在 37°C 下孵育 1 小時； 然后，使用原位細胞死亡熒光素檢測試劑盒檢測細胞凋亡。
葡萄糖水平測定和YO-PRO1染色：將斑馬魚幼蟲（n=20）勻漿并以12000 rpm離心1分鐘。使用血糖儀測量總葡萄糖水平。為了觀察HCs，胚胎在28.5°C下用YO-PRO1在EM中培養(yǎng)1小時，然后用EM沖洗。
定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT PCR）：為了量化ins mRNA表達，使用LightCycler 96儀器和FastStart SYBR Green Master Mix進行qRT PCR。
結(jié)果：胰腺 β 細胞的消融導致 Tg(ins:nfsB-mCherry) 斑馬魚的高血糖：為了建立高血糖斑馬魚模型，我們制作了Tg（ins:nfsB-mCherry）斑馬魚，該斑馬魚在ins啟動子的控制下在胰腺β細胞中表達硝基還原酶（nfsB）融合的mCherry蛋白。nfsB將前藥MTZ轉(zhuǎn)化為細胞毒性產(chǎn)物，導致胰腺β細胞的特異性消融。我們觀察到，MTZ處理的轉(zhuǎn)基因幼蟲與DMSO處理的轉(zhuǎn)基因幼蟲（對照組）相比，在4 dpf時McHery+胰腺β細胞被消融。使用TUNEL分析（圖1C，D）檢測McHery+胰腺β細胞的凋亡，并使用原位RNA雜交（圖1E，F(xiàn)）和qRT PCR評估發(fā)現(xiàn)ins mRNA的表達降低。我們進一步證實，MTZ 處理的轉(zhuǎn)基因幼蟲的葡萄糖水平高于對照（圖 1J）。 這些數(shù)據(jù)表明胰腺 β 細胞的損傷會導致斑馬魚幼蟲出現(xiàn)高血糖。
圖 1. ALA 防止高血糖時毛細胞 (HC) 損失。
ALA可防止高血糖引起的HC損失：我們觀察到MTZ處理的轉(zhuǎn)基因幼蟲中HCs的數(shù)量低于對照組，YO-PRO1染色結(jié)果證明了這一點。相反，DMSO、ALA、DMSO和ALA聯(lián)合處理的轉(zhuǎn)基因幼蟲或MTZ處理的野生型幼蟲對HCs沒有影響。此外，與單獨使用MTZ處理的幼蟲相比，使用MTZ和ALA處理的幼蟲體內(nèi)HCs的數(shù)量更高。這些發(fā)現(xiàn)表明，ALA保護HCs免受高血糖誘導的細胞丟失。
討論：高血糖通過細胞內(nèi)信號通路如多元醇通路促進活性氧（ROS）的形成，進而直接損傷耳蝸，誘發(fā)聽力障礙。在本研究中，我們證明了代謝抗氧化劑ALA對糖尿病斑馬魚模型中HCs的高血糖丟失具有保護作用。我們的結(jié)果得到了先前研究的支持，這些研究表明，ALA通過清除ROS有效地防止順鉑誘導的小鼠耳毒性以及細胞培養(yǎng)中的HC損傷。此外，先前的一項研究報道，ALA通過抑制參與凋亡的p38和p-JNK的表達來減輕卡那霉素誘導的小鼠耳毒性。因此，我們認為 ALA 對高血糖引起的 HC 損失具有保護作用，并且可有效清除 ROS 和抑制細胞凋亡分子。幾項研究報道，ALA 可以恢復順鉑誘導大鼠周圍神經(jīng)毒性后周圍神經(jīng)的傳導速度，并減少 L-羥基戊二酸誘導斑馬魚腦神經(jīng)毒性后神經(jīng)元的凋亡。這些數(shù)據(jù)表明ALA具有神經(jīng)保護作用。Hong等人還表明，在化學誘導的糖尿病斑馬魚和小鼠模型中，胰腺β細胞壞死可導致感音神經(jīng)性聽力損失和高血糖后HCs的損失。因此，ALA 可能對斑馬魚的糖尿病性聽力損失具有神經(jīng)保護作用。
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