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摘要：紫外線對(duì)人類既有害又有益。本研究旨在探討紫外線C（UVC）對(duì)生物體的毒性和安全性，以及相應(yīng)的生物防御分子機(jī)制。，為增加 UVC 照射劑量，使用高效深紫外線發(fā)光二極管（278 nm）照射處于早期發(fā)育階段（受精后 5-6 小時(shí)）的斑馬魚(yú)胚胎，并評(píng)估包括存活率、孵化率、心率和畸形率在內(nèi)的形態(tài)學(xué)表型。與未照射的對(duì)照相比，所有暴露于 4.5 mJ/cm2 UVC 的斑馬魚(yú)胚胎都存活下來(lái)，并且在孵化和心率方面沒(méi)有顯著差異。然而，暴露于7.5 mJ/cm2  UVC 的斑馬魚(yú)胚胎存活率顯著下降 (37.5%) 和畸形率增加 (81.8%)。因此，選擇 4.5 mJ/cm2 作為斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)部生物防御系統(tǒng)抵御 UVC 輻射的極限劑量。對(duì)輻照后 3 分鐘和 3 天的胚胎（4.5 mJ/cm2）進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組分析（RNA 測(cè)序）揭示了斑馬魚(yú)胚胎對(duì)輻照反應(yīng)的分子機(jī)制。胚胎通過(guò)激活p53信號(hào)通路迅速對(duì)UVC誘導(dǎo)的應(yīng)激做出反應(yīng)。在恢復(fù)3天后，胚胎表現(xiàn)出信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)通路的激活。據(jù)我們所知，這是第一項(xiàng)評(píng)估斑馬魚(yú)胚胎在 278 nm UVC 照射下的毒理學(xué)效應(yīng)和生物防御分子機(jī)制的研究。

簡(jiǎn)介：紫外線（UV）輻射由太陽(yáng)自然發(fā)射，根據(jù)波長(zhǎng)范圍可分為三種類型：315至400 nm的長(zhǎng)波紫外線A（UVA）、280至315 nm的中波紫外線B（UVB）和100至280 nm的短波紫外線C（UVC）。大氣和臭氧層可以完全過(guò)濾UVC，只有UVA（太陽(yáng)紫外線能量的90-99%）和部分UVB（太陽(yáng)紫外線總能量的1-10%）到達(dá)地球表面。紫外線輻射是威脅人類健康的一個(gè)顯著風(fēng)險(xiǎn)因素。過(guò)度暴露于紫外線會(huì)導(dǎo)致白內(nèi)障、光老化、紅斑、色素沉著和皮膚癌。然而，適當(dāng)劑量的紫外線輻射可能有益于人類健康，比如治療新生兒黃疸和老年佝僂病的紫外線療法。在三種類型的紫外線輻射中，UVC 是最有能量的，因此也是最危險(xiǎn)的。 短波紫外線燈 (254 nm) 常用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或醫(yī)療設(shè)施中以滅活細(xì)菌和病毒，但它也會(huì)對(duì)人類造成巨大的 DNA 損傷。眾所周知，UVC 對(duì)人體有害。 最近，222nm遠(yuǎn)紫外線照射在微生物殺菌方面表現(xiàn)出極好的效果，被認(rèn)為對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚是安全的。另一項(xiàng)研究報(bào)告稱，207 nm 的紫外光可有效殺死微生物，而不會(huì)傷害暴露的人體組織。在 2019 年冠狀病毒病 (COVID-19) 大流行期間，皮膚耐受的遠(yuǎn)紫外線 (< 240 nm) 因其對(duì)包括嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 在內(nèi)的人類冠狀病毒的高效滅活而備受關(guān)注。此外，需要對(duì)其他UVC波長(zhǎng)（240–280 nm）對(duì)活生物體的輻射效力、毒性和安全性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)包括易于飼養(yǎng)、高繁殖力、快速發(fā)育、發(fā)育早期的光學(xué)透明性、與人類的遺傳和解剖高度相似性，以及易于基因操作。斑馬魚(yú)胚胎已被廣泛用作毒理學(xué)、環(huán)境污染危害研究和藥物開(kāi)發(fā)研究的模式生物。此外，斑馬魚(yú)是皮膚病學(xué)領(lǐng)域的合適模型，因?yàn)樗鼈冊(cè)谶z傳學(xué)和皮膚發(fā)育方面與人類表現(xiàn)出明顯的相似性。Li等人指出，與小鼠相比，斑馬魚(yú)是一種更好的人體皮膚疾病模型生物。因此，斑馬魚(yú)被廣泛用于模擬人類皮膚疾病，如大皰性表皮松解癥、牛皮癬和黑色素瘤。在過(guò)去的幾十年里，紫外線輻射引起的健康風(fēng)險(xiǎn)引起了人們的關(guān)注，人類培養(yǎng)細(xì)胞或人類皮膚中潛在的基因圖譜也得到了研究。然而，由于使用了不同的組織模型，關(guān)于紫外線誘導(dǎo)途徑的具體信息很少。因此，斑馬魚(yú)被認(rèn)為是系統(tǒng)理解紫外線相關(guān)現(xiàn)象和基本機(jī)制的理想模型。 為什么斑馬魚(yú)是研究紫外線輻射影響的合適模型的另一個(gè)原因是斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物之間的光激活和 DNA 損傷修復(fù)途徑是保守的。之前的研究已經(jīng)評(píng)估了斑馬魚(yú)胚胎中UVA和UVB輻射的毒理學(xué)。例如，UVA暴露（320 nm）會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎中白細(xì)胞IL-1β的誘導(dǎo)和炎癥反應(yīng)。Chen等人報(bào)道，UVB輻射（312nm）導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎中junbb基因表達(dá)提前，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。然而，與UVC滅活SARS-CoV-2的效率研究相比，關(guān)于UVC的毒性、安全性以及生物體對(duì)UVC輻射的反應(yīng)的系統(tǒng)性報(bào)告很少。了解生物體如何保護(hù)和修復(fù)自身免受UVC損傷的潛在分子機(jī)制，可能有助于將來(lái)更好地利用UVC輻射。在這項(xiàng)研究中，我們研究了不同劑量的高效深紫外線發(fā)光二極管 (UVC-LED, 278 nm) 照射對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期原腸胚階段的影響。 測(cè)量了包括存活率、孵化率、畸形率和心率在內(nèi)的形態(tài)表型。 此外，耐受 UVC 輻照的胚胎被用于轉(zhuǎn)錄組分析，以揭示防止 UVC 光損傷的潛在分子機(jī)制。

不同劑量UVC輻射對(duì)斑馬魚(yú)形態(tài)的影響：早期原腸胚階段（5-6 hpf）的健康胚胎暴露于增加劑量的 UVC。 由于照射距離恒定為 50 cm，照射時(shí)間逐漸增加。照射后，暴露10 分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間（≥ 15 mJ/cm2）的胚胎在第二天表現(xiàn)出 100% 的死亡率，因此無(wú)法獲得相應(yīng)的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。在72 hpf下觀察胚胎形態(tài)，并照射0.5、1、2、3和5分鐘，分別相當(dāng)于0.75、1.5、3、4.5和7.5 mJ/cm2的UVC劑量，如圖1所示。在 4.5 mJ/cm2 照射下胚胎的存活率為 100%，而在 7.5 mJ/cm2 劑量下觀察到存活率快速下降（37.5%）。對(duì)照組顯示出最高的孵化率（96.7±3.3%），而在7.5 mJ/cm2暴露下72 hpf時(shí)觀察到最低值（6.7±2.5%）。對(duì)照組和暴露≤4.5 mJ/cm2 組的孵化率之間沒(méi)有顯著差異。 與對(duì)照組相比，所有暴露組的心率均無(wú)顯著差異。 盡管用 4.5 和 7.5 mJ/cm2 UVC 照射的胚胎顯示心率下降，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，在 1.5 mJ/cm2 或更少的 UVC 劑量照射的胚胎中未觀察到畸形。在 3、4.5 和 7.5 mJ/cm2 的 UVC 下的畸形率分別為 2.5%、12.5% 和 81.8%。輻照后獲得的典型圖像如圖 1E 所示。暴露于4.5 mJ/cm2 的主要畸形是尾巴略微彎曲。 暴露于 7.5 mJ/cm2 的斑馬魚(yú)胚胎中觀察到更嚴(yán)重的發(fā)育畸形，如心包水腫、脊柱彎曲、卵黃囊水腫、尾巴畸形和生長(zhǎng)遲緩。

圖 1. 72 hpf 時(shí)斑馬魚(yú)胚胎的形態(tài)測(cè)量。 斑馬魚(yú)早期原腸胚階段（5-6 hpf）的胚胎暴露于不同劑量的 UVC（0、0.75、1.5、3、4.5 和 7.5 mJ/cm2）。（A） 照射后斑馬魚(yú)胚胎的存活率、孵化率、心率和畸形率。（E） 對(duì)照組和UVC照射胚胎的代表性圖像。

UVC輻射誘導(dǎo)生物防御系統(tǒng)的分子機(jī)制：盡管觀察到了輕微的畸形，但所有接受 4.5 mJ/cm2 UVC 照射的斑馬魚(yú)胚胎都存活了下來(lái)，表明這種輻照強(qiáng)度可能時(shí)胚胎內(nèi)部生物防御系統(tǒng)抵御 UVC 輻射的極限。因此，我們?cè)陔S后的分析中使用該輻射強(qiáng)度來(lái)揭示這種生物防御的分子機(jī)制。在 4.5 mJ/cm2 的 UVC 照射后，在 3 mpi 和 3 dpi 收集胚胎進(jìn)行 RNA-seq 分析，，分別作為對(duì)UVC照射的快速反應(yīng)和晚期反應(yīng)的測(cè)量。圖2顯示了在3 mpi和3 dpi下UVC輻照胚胎的轉(zhuǎn)錄組圖譜。

圖 2. UVC 照射和對(duì)照胚胎的轉(zhuǎn)錄組圖譜。

對(duì)UVC輻射的快速反應(yīng)：在 22874 個(gè)測(cè)序的斑馬魚(yú)基因中，選擇參數(shù)設(shè)置為 FDR < 0.05 和絕對(duì)倍數(shù)變化≥ 1.5 的差異表達(dá)基因（DEGs），結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何基因。選擇參數(shù)設(shè)置為p < 0.05，絕對(duì)倍數(shù)變化≥ 1.5， 共鑒定出96個(gè)DEG，包括40個(gè)上調(diào)基因和56個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)分別輸入上調(diào)和下調(diào)的DEG獲得的生物過(guò)程（BP_ALL）類別如圖3A所示。GO 分析是使用免費(fèi)工具 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 6.8 進(jìn)行的。表達(dá)上調(diào)基因與細(xì)胞過(guò)程（GO:0008037，細(xì)胞識(shí)別；GO:0045216，細(xì)胞-細(xì)胞連接組織；GO:0034330，細(xì)胞連接組織；GO:1903530，細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)；GO:0044763，單體細(xì)胞過(guò)程）和定位（GO:0051179，定位；GO:0044765，單體轉(zhuǎn)運(yùn)；GO:0051046，分泌調(diào)節(jié)）有關(guān)。幾個(gè)下調(diào)基因與細(xì)胞死亡（GO:0043066，凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控；GO:0043069，程序性細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控；GO:0060548，細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控）和發(fā)育過(guò)程（GO:0072359，循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育；GO:0072358，心血管系統(tǒng)發(fā)育）有關(guān)。

圖 3、 斑馬魚(yú)胚胎對(duì) UVC 照射 (3 mpi) 的快速反應(yīng)與相同發(fā)育階段對(duì)照胚胎的 DEG 生物信息學(xué)分析。

生物信息學(xué)分析顯示，對(duì)UVC輻射反應(yīng)最快的三種生物轉(zhuǎn)化是“應(yīng)激反應(yīng)”，其次是“防御反應(yīng)”和“免疫反應(yīng)”。此外，還研究了UVC輻射調(diào)節(jié)的生物途徑，前三個(gè)受調(diào)節(jié)的途徑是“p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”、“Nectin/NECL信號(hào)途徑”和“BLIMP-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”。IPA軟件預(yù)測(cè)的最高監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)如圖3B所示，它與“疾病和功能”有關(guān)，如“聽(tīng)覺(jué)疾病、神經(jīng)疾病、器官損傷和異常”。與GO分析結(jié)果一致，通過(guò)通路分析確定了一個(gè)下調(diào)的“B淋巴細(xì)胞分化”網(wǎng)絡(luò)，以及一個(gè)上調(diào)的“細(xì)胞-細(xì)胞接觸”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)對(duì)UVC輻射反應(yīng)迅速。

我們進(jìn)一步進(jìn)行了 qPCR 以驗(yàn)證快速響應(yīng) UVC 照射的頂級(jí)調(diào)節(jié)生物通路，即 p53 信號(hào)通路。 KeyMolnet 軟件預(yù)測(cè)的 p53 的計(jì)算機(jī)分子網(wǎng)絡(luò)的細(xì)節(jié)如圖 4A 所示。該網(wǎng)絡(luò)中的15個(gè)關(guān)鍵基因被選擇用于qPCR。紫外線照射后，p53上游的基因，即ATM絲氨酸/蘇氨酸激酶顯著上調(diào)（2.75倍；p?<?0.05），并且p53的表達(dá)在UVC照射的胚胎中顯著上調(diào)（與對(duì)照組相比）（1.3倍；p?<?0.01)。此外，polo 樣激酶 4（plk4）、聚合酶kappa（polk）和 BCL2 結(jié)合組分 3（bbc3） 顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比，在 UVC 照射組中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 1（cdk1）顯著下調(diào)。

圖4、p53通路參與斑馬魚(yú)胚胎對(duì)UVC輻射（3mpi）的快速反應(yīng)的分子機(jī)制。

紫外線照射后的遲發(fā)反應(yīng)：在 3 dpi 斑馬魚(yú)胚胎中，在 24,507 個(gè)測(cè)序基因中，參數(shù) FDR < 0.05 和絕對(duì)倍數(shù)變化≥ 1.5僅篩選出 9 個(gè) DEG。然而，當(dāng)選擇參數(shù)設(shè)置為p?<?0.05和絕對(duì)倍數(shù)變化≥?1.5共鑒定出192個(gè)DEG，包括89個(gè)上調(diào)基因和103個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)分別輸入上調(diào)和下調(diào)的DEG獲得的生物過(guò)程類別如圖5A所示。對(duì)于上調(diào)基因，與生物調(diào)節(jié)（GO:0010817，激素水平調(diào)節(jié)；GO:0042592，穩(wěn)態(tài)過(guò)程）、細(xì)胞代謝過(guò)程（GO:0006721，萜類代謝過(guò)程；GO:0034754，細(xì)胞激素代謝 過(guò)程）和對(duì)刺激的反應(yīng)（GO:0009581，檢測(cè)外部刺激；GO:0009582，檢測(cè)非生物刺激）有關(guān)。下調(diào)的 DEG 與細(xì)胞反應(yīng)（GO:0022411，細(xì)胞成分分解；GO:0044763，單生物細(xì)胞過(guò)程；GO:1900543，嘌呤核苷酸代謝過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)；GO:0045980，核苷酸代謝過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)； GO：0051716，細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)）和對(duì)刺激的反應(yīng)（GO：0009611，對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)；GO：0071496，細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)；GO：0042060，傷口愈合；GO：0031668，細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)；GO :0043401，類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路）有關(guān)。

圖 5. 斑馬魚(yú)胚胎對(duì) UVC 照射 (3 dpi) 的晚期反應(yīng)與對(duì)照胚胎相同發(fā)育階段之間的 DEG 的生物信息學(xué)分析。

在紫外線照射3天后，對(duì)UVC產(chǎn)生反應(yīng)的前三種生物轉(zhuǎn)化是“轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)，DNA模板化”，其次是“細(xì)胞群體增殖的調(diào)節(jié)”和“細(xì)胞死亡”。按 p 值排列的前三個(gè)調(diào)節(jié)途徑是“STAT 轉(zhuǎn)錄調(diào)控”，其次是“AP-1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控”和“NFκB 轉(zhuǎn)錄調(diào)控”。與“疾病和功能”相關(guān)的是“皮膚病和狀況、器官形態(tài)、器官損傷和異常”功能。此外，作為對(duì) UVC 照射的晚期反應(yīng)，“類視黃醇的代謝”和“淋巴樣細(xì)胞的擴(kuò)張”被上調(diào)，“傷口愈合”被下調(diào)。參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的種子基因1a和stat3在UVC照射下顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比，上游和下游基因的表達(dá)，包括atm、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）、δ（cebpd）、BCL2凋亡調(diào)節(jié)器δ、MCL1凋亡調(diào)節(jié)器，BCL2家族成員b（mcl1b）、birc5a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子Ab、MYC原癌基因、bHLH轉(zhuǎn)錄因子a（myca），細(xì)胞周期蛋白D2（ccnd2a）在紫外線照射的胚胎中也顯著上調(diào)。

圖6、斑馬魚(yú)胚胎對(duì)UVC輻射（3 dpi）的后期反應(yīng)中，基于qPCR驗(yàn)證編碼STAT通路中間產(chǎn)物的基因的表達(dá)。

結(jié)論：由于 UVC 具有殺菌效果和低皮膚滲透性，預(yù)計(jì) UVC 將用于消毒，特別是用于根除 SARS-CoV-2。在這項(xiàng)研究中，我們首次確定了UVC輻射在斑馬魚(yú)胚胎中的毒理學(xué)劑量及其轉(zhuǎn)錄組圖譜。斑馬魚(yú)胚胎在恢復(fù)三天后通過(guò)立即激活p53和STAT信號(hào)通路來(lái)應(yīng)對(duì)應(yīng)激。我們進(jìn)行了進(jìn)一步的哺乳動(dòng)物研究，以驗(yàn)證我們?cè)诎唏R魚(yú)胚胎中的結(jié)果。由于不同的UVC波長(zhǎng)可能具有不同的效率，因此需要進(jìn)一步研究。

原文出自：Transcriptome analysis of molecular response to UVC irradiation in zebrafish embryos - ScienceDirect