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生物發光 Bioluminescence

要讓小鼠自發光，靠的是生物發光過程，也就是讓熒光素酶催化底物氧化反應，產生發射光。

我們可以將熒光素酶（luciferase）基因，如：螢火蟲熒光素酶，整合到細胞或動物 DNA 中以表達熒光素酶，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，外源給予底物熒光素（luciferin），熒光素酶催化底物氧化反應產生發射光。只有活細胞內才會產生發光現象，且光的強度與標記細胞的數目成正比。

實驗室常用的熒光素酶有：

活體動物體內可見光成像 In Vivo Optical Imaging

主要采用生物發光成像 (BLi,Bioluminescence imaging) 和（或）熒光成像 (Fluorescence imaging) 技術，對細胞、細菌、病毒、蛋白、抗體、核酸、小分子藥物分子和納米材料等進行標記，并通過超高靈敏度相機采集產生的微弱信號，從而了解研究對象在體內的生物學反應和過程，實時觀察動物體內腫瘤的生長及轉移、疾病發生發展過程、材料或藥物在體內的代謝、基因表達等生物學過程。

IVIS （In Vivo Imaging Systems）

小動物活體光學成像系統，通過配備的高靈敏CCD相機、不透光成像室和全自動化的分析功能，具有高靈敏度生物發光和熒光成像性能，使我們能夠更全面地了解小動物模型體內復雜的細胞活動和基因行為。

基于BLi的IVIS檢測優勢

1.更靈敏

生物發光不需要激發光，特異性強，被組織吸收少，動物體內無自發光，因此生物發光背景低、信噪比高，與熒光蛋白的熒光成像相比，生物發光成像體內檢測更靈敏，可用于精確測量。

2.非侵入

采用非侵入式方法，實時連續動態檢測體內的各種生物學過程，從而減少實驗動物數量，降低個體差異的影響，有利于長期觀察。

應用領域

基因表達、蛋白質間相互作用、癌癥研究、免疫學研究、干細胞研究、神經疾病研究、藥物研發與藥效評估等等。

舉例

1.實時監測腫瘤細胞增殖和轉移

無論皮下荷瘤還是特定組織內腫瘤，傳統的方法均無法在保證荷瘤小鼠存活的條件下檢測體內原位或者轉移腫瘤；而利用IVIS可以長時間不同時間點、無創傷的定量檢測小鼠腫瘤。比如下圖：將熒光素酶標記的結腸癌細胞株注射到裸鼠腦內，利用IVIS可以在固定時間點觀察和統計腦內腫瘤的生長和轉移。

2.利用基因工程小鼠模型實時檢測炎癥相關因子表達變化

• IL1β-Luc 轉基因小鼠

通過顯微注射技術構建的受人 IL-1β promoter 調控的 Luciferase 轉基因小鼠，在 LPS 注射刺激后的不同時間點分別進行背部以及腹部成像檢測，觀察小鼠整體熒光表達變化，并且能夠模擬內源性 IL-1β 變化趨勢。

IL-1β轉基因小鼠在LPS刺激后不同時間點的雄性（Male）和雌性（Female）小鼠熒光表達變化（左圖）以及內源性IL-1β相對表達定量結果（右圖）。

• Il1a-Luc 基因敲入小鼠

通過 CRISPR/Cas9 技術構建內源 Il1a-Luc 基因敲入小鼠模型，在 LPS 注射后不同時間點進行熒光成像檢測，可實時觀測內源 Il1a 基因的表達強度變化。

參考文獻

1、Lim E., et al. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp, 2009, (26)

2、Li L., et al. Functional imaging of interleukin 1 beta expression in inflammatory process using bioluminescence imaging in transgenic mice. BMC Immunol, 2008, 9:49

3、Mezzanotte L., et al. In Vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends Biotechnol. 2017 Jul;35(7):640-652.