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目的基因過(guò)表達(dá)，是研究基因功能的主要方法之一。其中，如何確保目的基因準(zhǔn)確無(wú)誤的表達(dá)是非常關(guān)鍵的一步。因?yàn)槟康幕虮磉_(dá)過(guò)量或者在不恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間表達(dá)都會(huì)影響到細(xì)胞狀態(tài)或者機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。四環(huán)素(Tetracycline, Tet)調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)便可以做到對(duì)基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，今天小編便來(lái)介紹這一神奇的基因開(kāi)關(guān)。

四環(huán)素調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)

四環(huán)素調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)是以大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子上Tet抗性操縱子為基礎(chǔ)而建立的。在細(xì)菌系統(tǒng)中，正常情況下，tetR將與tetO結(jié)合，抑制下游抗性基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)存在四環(huán)素或者四環(huán)素類(lèi)似物如強(qiáng)力霉素時(shí)，tetR將與四環(huán)素結(jié)合，不再和tetO結(jié)合，造成下游抗性基因表達(dá)，細(xì)菌從而獲得耐藥性[1]。

圖1 TetR和tetO在四環(huán)素耐藥菌中的作用原理[1]

注：在沒(méi)有四環(huán)素的情況下，TetR（紫色實(shí)心圓）以高親和力與兩個(gè)四環(huán)素操縱子tetO1和tetO2 結(jié)合。這導(dǎo)致四環(huán)素外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 TetA 的抑制。如果存在四環(huán)素時(shí)（黑色三角形），四環(huán)素與 Mg2+形成復(fù)合物（紅色三角形）。該復(fù)合物與 TetR 結(jié)合，這導(dǎo)致TetR 與tetO分離，TetA得以表達(dá)。

由此可見(jiàn)，四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵元件是四環(huán)素反應(yīng)元件（TRE）和四環(huán)素阻遏蛋白（TetR）。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，這一系統(tǒng)也經(jīng)過(guò)了多次優(yōu)化，現(xiàn)在常用的TRE是由7個(gè)長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸的四環(huán)素抗性操縱子(TetO)組成，TRE及下游CMV啟動(dòng)子共同組成了四環(huán)素依賴(lài)性啟動(dòng)子（Ptet）。而對(duì)TetR的改造，使得多種Tet調(diào)控系統(tǒng)逐漸發(fā)展起來(lái)，應(yīng)用最為廣泛的便是抑制型系統(tǒng)Tet-off和激活型系統(tǒng)Tet-on。

Tet-off系統(tǒng)

Gossen 和Bujard最初構(gòu)建的系統(tǒng)便是Tet-off系統(tǒng)，即在四環(huán)素存在的情況，目的基因表達(dá)水平降低或者不表達(dá)。為了達(dá)到這一目的，人們對(duì)大腸桿菌TetR進(jìn)行了改造，將皰疹病毒的 VP16 蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域融合到TetR上，從而合成了反式激活蛋白tTA，改變了TetR阻遏蛋白的屬性。在缺乏四環(huán)素時(shí)，tTA 將和TRE結(jié)合，VP16會(huì)使Ptet活化從而使基因表達(dá)促進(jìn)目的基因表達(dá)，而在四環(huán)素存在時(shí)，tTA則與四環(huán)素結(jié)合，抑制目的基因表達(dá)[2]。

Tet-on系統(tǒng)

1995年，Gossen等發(fā)現(xiàn)了tetR參與四環(huán)素誘導(dǎo)的抑制反應(yīng)的關(guān)鍵的4個(gè)氨基酸殘基，這些氨基酸殘基突變后可發(fā)生反向的反應(yīng)，即在四環(huán)素存在的條件下，目的基因能夠表達(dá)蛋白，而缺失四環(huán)素時(shí)，目的基因無(wú)法表達(dá)。新的反式激活蛋白被稱(chēng)為rtTA，由rTetR與VP16融合而成[2]。

圖3 Tet-on系統(tǒng)原理

經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，人們對(duì)Tet-on系統(tǒng)的啟動(dòng)子和活化因子進(jìn)行了持續(xù)的優(yōu)化，使目的基因在沒(méi)有四環(huán)素的情況下表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和更低的背景活性，在有四環(huán)素誘導(dǎo)情況下有更高的表達(dá)水平。其中，TRE3G和rtTA2 S -M2 變體表現(xiàn)出對(duì)四環(huán)素的高敏感性，成為目前廣泛應(yīng)用的四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的元件[3][4]。

圖4 Tet抗性操縱子、Tet-Off和Tet-On系統(tǒng)原理[3]

四環(huán)素調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)小鼠模型

四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)主要通過(guò)pTRE和tTA/rtTA兩部分相互配合完成基因表達(dá)調(diào)控的功能。因此，利用四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的調(diào)控，原則上需要建立兩種小鼠。

首先，建立pTRE小鼠，需將目的基因插入到四環(huán)素依賴(lài)性啟動(dòng)子下游，使目的基因的表達(dá)受四環(huán)素的控制。其次，需要建立tTA或者rtTA小鼠，該小鼠中的tTA/rtTA激活因子由特定啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可在特定細(xì)胞或者組織或者全身表達(dá)tTA或者rtTA。

這兩種小鼠繁育后，可獲得子代小鼠中既帶有pTRE及目的基因又帶有tTA/rtTA的小鼠，即可實(shí)現(xiàn)通過(guò)四環(huán)素的有無(wú)來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。

Tet-off小鼠模型

Tet-off小鼠模型是通過(guò)tTA小鼠同pTRE小鼠交配獲得。主要可應(yīng)用于調(diào)控目的基因過(guò)表達(dá)的水平。例如，Giles等通過(guò)構(gòu)建α-MHC-tTA; pTRE-cMyBP-C小鼠，進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)（Rescueexperiments），即將α-MHC-tTA鼠、pTRE-cMyBP-C鼠同cMyBP-C 敲除鼠交配，利用四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)在cMyBP-C 敲除小鼠中恢復(fù)cMyBP-C的表達(dá)，進(jìn)而驗(yàn)證了cMyBP-C缺陷造成的心肌肥大的表型是可逆的。在這一系統(tǒng)中，通過(guò)注射四環(huán)素，還可以瞬時(shí)降低cMyBP-C的表達(dá)。可見(jiàn)，Tet-Off實(shí)現(xiàn)可以對(duì)基因的功能的全面的研究[5]。

圖5 Tet-off小鼠模型

Tet-on小鼠模型

Tet-On小鼠模型是通過(guò)rtTA小鼠同pTRE小鼠交配獲得。主要應(yīng)用于誘導(dǎo)目的基因過(guò)表達(dá)。例如，Song等通過(guò)構(gòu)建Alb-rtTA小鼠，再注射pTRE-uPA腺病毒，制備肝臟損傷模型。Alb是肝臟特異表達(dá)的基因，uPA則是肝毒性物質(zhì)，在注射四環(huán)素后，rtTA在Alb啟動(dòng)子的作用下，將在肝臟中同pTRE結(jié)合，進(jìn)而過(guò)表達(dá)下游基因uPA，造成肝臟損傷[6]。

圖6 Tet-on小鼠模型

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

目前，除四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)以外，科學(xué)家們還開(kāi)發(fā)了多種條件性基因調(diào)控系統(tǒng)，如Cre-loxp系統(tǒng)、Flp-frt系統(tǒng)、Dre-rox系統(tǒng)等，而四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)仍具有自己的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

首先Tet-On系統(tǒng)在沒(méi)有誘導(dǎo)時(shí)目的基因的表達(dá)水平比較低，誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)水平增高，最高誘導(dǎo)倍數(shù)可達(dá)10000倍。

其次原核來(lái)源的TetR與TetO的結(jié)合特異性高，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒(méi)有類(lèi)似的DNA靶向序列，所以Tet系統(tǒng)調(diào)控特異性高，并且宿主基因不受到影響，適合于體內(nèi)外的各種基因表達(dá)的調(diào)控。

同時(shí)，Tet系統(tǒng)的誘導(dǎo)藥物為T(mén)et或Dox，Tet作為一種抗生素已被人們應(yīng)用了很長(zhǎng)時(shí)間，是對(duì)人體較為安全的一種藥物，并且在Tet系統(tǒng)中低劑量的Tet就可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，所以不會(huì)對(duì)動(dòng)物或細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)毒性。

最后一點(diǎn)是，四環(huán)素系統(tǒng)具有可逆性，在去除誘導(dǎo)劑后可使系統(tǒng)關(guān)閉，也可反復(fù)加入誘導(dǎo)劑，多次啟動(dòng)誘導(dǎo)反應(yīng)。

南模生物深耕基因編輯領(lǐng)域，在四環(huán)素誘導(dǎo)小鼠模型構(gòu)建上有著成熟的技術(shù)和豐富的經(jīng)驗(yàn)，為您的基因功能研究之路保駕護(hù)航。已有和部分在研的四環(huán)素誘導(dǎo)動(dòng)物模型信息見(jiàn)下表：

Reference:

[1]2013.igem.org/Team:Bielefeld-Germany/Biosafety/Biosafety_System_M

[2]www.addgene.org/collections/tetracycline

[3] Das AT, Tenenbaum L, Berkhout B. Tet-OnSystems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther.2016;16(3):156-67.

[4] Loew R,Heinz N, Hampf M, Bujard H, Gossen M. Improved Tet-responsive promoters withminimized background expression. BMC Biotechnol. 2010 Nov 24;10:81.

[5] Giles J,Patel JR, Miller A, Iverson E, Fitzsimons D, Moss RL. Recovery of leftventricular function following in vivo reexpression of cardiac myosin bindingprotein C. J Gen Physiol. 2019 Jan 7;151(1):77-89.

[6] Song X, GuoY, Duo S, Che J, Wu C, Ochiya T, Ding M, Deng H. A mouse model of inducibleliver injury caused by tet-on regulated urokinase for studies of hepatocytetransplantation. Am J Pathol. 2009 Nov;175(5):1975-83.