TEL:17312606166（魏經(jīng)理）
美鳳力臨床前大動物實驗中心
17312606166
ES細胞打靶技術(shù)
CRISPR/Cas9技術(shù)
在小鼠胚胎干細胞（ES 細胞）中進行 DNA 同源重組，將 ES 細胞重新注射到囊胚腔中，可以形成嵌合胚胎，并能在假孕小鼠體內(nèi)發(fā)育，最終發(fā)育為嵌合體小鼠。這種嵌合小鼠的組織細胞（包括生殖細胞）可以分別來自囊胚的細胞和被注射的ES細胞。因此，通過嵌合小鼠和野生型小鼠的交配，ES 細胞中的遺傳信息就能夠傳遞到后代的小鼠個體中。
利用ES細胞打靶技術(shù)建立基因修飾小鼠模型的主要技術(shù)路線：
（1）構(gòu)建重組基因載體（正負雙向選擇系統(tǒng)）
（2）用電穿孔等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體ES細胞內(nèi)
（3）用選擇培養(yǎng)基篩選抗藥ES細胞，并利用PCR或或 Southern blot 等方法鑒定發(fā)生正確同源重組的ES細胞
（4）將中靶ES細胞注射到受體囊胚中，將注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宮中，讓其受孕，待小鼠出生后，通過觀察毛色的嵌合與否和嵌合程度判斷是否獲得嵌合體小鼠。
CRISPR/Cas是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種高度保守的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（規(guī)律成簇間隔短回文重復）的縮寫。CRISPR簇是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復序列家族，其序列由一個前導區(qū)(Leader)、多個短而高度保守的重復序列區(qū)(Repeat)和多個間隔區(qū)(Spacer)組成。
Cas則是在CRISPR附近的一個多態(tài)性家族基因，這個家族基因編碼的蛋白均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域，并且與CRISPR區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因(CRISPR associated)，縮寫為Cas，包括Cas1～Cas10等多種類型。
當細菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時，在前導區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄成pre-crRNA，然后被加工成一系列短的含有保守重復序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識別并結(jié)合到與其互補的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。
圖3. 細菌CRISPR/Cas系統(tǒng)抵御外來入侵原理示意圖（圖片來自Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-78.）
目前在基因編輯應(yīng)用最為廣泛的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是以Cas9蛋白以及向?qū)NA（gRNA）為核心組成。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白質(zhì)中部的HNH兩個活性位點，在crRNA成熟和雙鏈DNA剪切中發(fā)揮作用，引起DNA雙鏈斷裂。CRISPR/Cas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(qū)（Protospacer Adjacent Motif）的NGG位點，這種特征的序列在每128bp的隨機DNA序列中就重復出現(xiàn)一次。
圖4. CRISPR/Cas9基本結(jié)構(gòu)原理示意圖（圖片By Mariuswalter - Own work, CC BY-SA 4.
DNA雙鏈斷裂后，在不存在同源模板的情況下發(fā)生非同源性末端接合（Non-homologous end joining,NHEJ）修復斷裂DNA。通常在Cas9剪切位點附近造成小片段堿基的插入或缺失。如果隨機修復發(fā)生在基因的編碼外顯子中，則往往會導致讀碼框發(fā)生移碼突變，最終使靶基因無法正常轉(zhuǎn)錄翻譯。當DNA斷裂后，細胞核內(nèi)同時存在與損傷DNA同源的DNA片段，那么則可通過同源介導的雙鏈DNA修復（Homology directed repair ，HDR）在目的位點引入外源DNA片段，從而達到片段敲入或編輯的效果。
利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的這些特性，CRISPR/Cas9途徑獲得基因修飾小鼠模型的主要技術(shù)路線：
（1）我們可以針對基因組特定序列設(shè)計向?qū)NA（gRNA）
（2）體外轉(zhuǎn)錄gRNA以及編碼Cas9蛋白的mRNA
（3）將gRNA、Cas9 mRNA注射到小鼠受精卵中
（4）注射后的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管中，受精卵發(fā)育成F0代小鼠。
由于高等真核細胞內(nèi)外源DNA與靶細胞DNA序列自然發(fā)生同源重組的機率非常低，約為百萬分之一，要把基因敲除成功的細胞篩選出來是一件非常困難的工作。因此，需要借助一些篩選標記來解決這一關(guān)鍵問題。
“+” 正篩選標記：通常是藥物抗性基因，最常用的就是Neo（新霉素抗性基因）。通過構(gòu)建打靶載體，將帶有目的片段的外源DNA序列連同正篩選基因 neo 通過 DNA 序列間的同源重組替代基因組中需要敲除或修飾的片段，達到敲除或敲入特定基因的目的。正篩選基因 neo的表達賦予重組 ES 細胞具有抵抗細胞毒性藥物 G418的特性，使細胞在藥物篩選下存活并形成細胞克隆。
“-” 負篩選標記：為減少因隨機插入產(chǎn)生的藥物抗性克隆對篩選的干擾，可以在打靶載體同源重組區(qū)域的外側(cè)加上負篩選基因，通常是細胞毒性相關(guān)基因。例如來自皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因，該基因可以將對細胞無毒的核苷類似物 Ganc 進行磷酸化，從而產(chǎn)生對細胞有毒的核苷酸類似物。 當打靶載體在細胞內(nèi)進行同源重組時，TK 基因由于在同源重組區(qū)域的外側(cè)，因此不會整合到細胞染色體上，隨著細胞的生長和分裂 TK 基因發(fā)生自然降解和稀釋，從細胞中消失。因此這類細胞不會因為 Ganc 的存在而死。但如果發(fā)生打靶載體隨機插入整合到 ES 細胞染色體上的情況，那么TK 基因很可能也會同時整合上去，結(jié)果導致這類非正確同源重組的ES細胞在 Ganc 的存在下生成有毒的核苷酸類似物而致死。
| 上一篇：小鼠胚胎首次在太空中生長 | 下一篇：經(jīng)典的模式生物都有哪些？大腸桿菌、擬南芥、近交系小鼠、果蠅 |
|
|
|
|
