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動物行為學的實驗方法及評分方法

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動物行為實驗由于是動物整體生理和心理狀態綜合、全面和實時效應的反應,被認為是人類疾病表現和發病機制研究,新藥發現、安全和風險監測分析的基本實驗手段,在醫學、藥學、生命科學和軍事醫學等研究領域具有不可替代的地位和作用,越來越受到國際科學界的廣泛重視。

動物行為實驗方法(experimental methodology based on animal behavior research)是動物行為學的重要內容,是融合動物學、醫學、藥學、生物學、電子工程、計算機和信息等多學科的基礎理論、技術和方法,以正常和(或)實驗動物為對象,在自然界或實驗室內,以觀察和實驗方式對動物的行為信息進行采集、分析和處理,將其實驗結果類比和推演到人,研究其行為信息的生理和病理意義的新興學科。

接下來主要從模型評價實驗方法和評分方法兩個方面進行詳細的說明。

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一、行為學實驗方法
01

學習及記憶能力

學習記憶功能異常是絕大多數神經系統疾病的臨床特征,如阿爾茨海默癥,帕金森病,癲癇,精神分裂,腦癱,腦卒中等。

學習是神經系統接受外界環境變化獲得新行為和經驗的過程,記憶是指對學習獲得的經驗或行為的保持,包括獲得、鞏固、再現及再鞏固四個環節。學習和記憶二者是互相聯系的神經活動過程。可用來評估小鼠的學習能力、記憶能力,可通過橫向、縱向比較獲得不同變量影響下或不同時期的小鼠學習記憶能力。

① Morris 水迷宮實驗:通過測定不同入水點下實驗動物尋找并爬上平臺所需要的時間,是一種評價擬癡呆動物模型的理想方法,用于評價動物的學習和記憶能力。

② 空間搜索實驗:依次從一、二、三象限入水點將動物放入水中,分別 3 次記錄動物 90 s 內在目標象限的游泳時間(第四象限),有效區停留時間、經過站臺次數、經過有效區次數。多用于反應動物對事物記憶的保持能力。

③ 探孔實驗:將實驗動物放于探孔板(4×4 排列)的中心,記錄實驗動物在 3、4、5 min 時將頭深入探孔中的次數。為評價實驗動物基本探索能力的檢測。又稱洞板實驗,是基于小鼠具有探洞的天性,從而評價其對新環境的探索能力。隨著時間的延長及反復進入洞板儀次數的增多探洞次數明顯減少,從而產生適應性的特點,洞板實驗也曾被一些學者應用于評價對于小鼠的記憶力。

④ 跳臺實驗:給予箱底連續 5 min 的交流電刺激,記錄每只大鼠收到電擊后跳上平臺的次數,此為正常的躲避傷害性刺激的反應。將大鼠跳上平臺的次數作為學習成績。24 h 后重新實驗,在通電的情況下,直接將大鼠置于平臺上,記錄其第一次跳下平臺的潛伏期和 5 min 內的錯誤次數作為記憶的成績。常用于評價實驗動物的記憶能力。

⑤ Y 形迷宮實驗:給予溫和的足部電擊,行為反應為動物逃避曾經遭受過電擊刺激的地方,以每只大鼠受到電擊的次數作為學習成績,24 h 后重新測試時的潛伏期和錯誤次數則作為記憶的成績。能夠簡便的對學習記憶能力進行評價。

⑥ 被動回避實驗:第 1 天將動物放入有照明的箱內,實驗動物會通過小門進入暗箱,讓其滯留于暗箱中 30 s 后放回籠中。第 2 天同第 1 天,但是待其在暗箱中時,給予足底電擊,持續 1.5 s 后取出動物。第 3 天時記錄動物從照明箱進入暗箱的延遲時間。延遲的時間越長,代表其學習能力越好。

02
耐力及運動能力

運動功能檢測是實驗動物行為學檢測的重要內容。動物的每一種行為學檢測方法都需要動物進行運動。另外,運動功能障礙也是帕金森病、腦缺血等中樞神經系統疾病的主要臨床表現。

運動行為實驗方法包括:

(1)一般運動行為學評價,如曠場實驗;

(2)協調運動評價如滾軸、平衡木實驗等;

(3)肌力評價如握力實驗;

(4)耐力行為學評價,如負重游泳、跑臺實驗等。

① 轉棒實驗:實驗動物在轉棒儀器上以4 r/min的速度適應 10 min 后,休息 30 min,以勻速 10 min 內4~40 r/min,記錄實驗動物掉下的速度和轉棒上保持的時間,用于評價實驗動物的運動能力。

② 采用踏步實驗:實驗動物沿著柵格移動時,前肢或后肢踩空,記錄為一次錯誤。正常的實驗動物,精細運動能力較好,踩空次數較少。而在缺血中風模型實驗動物中,踩空次數發生較多。檢測時,動物從一端放入,記錄 100 步所用時間、發生錯誤次數。

③ 跑步機實驗:將小鼠置于動物用跑步機上,在跑步機后部給予電擊。如果動物在后方點擊區域的停留時間超過 4 s,反應為動物力竭。記錄動物跑動的最長時間及受電擊次數。動物耐力用單位時間內受電擊的次數表示。

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03
協調能力

① 平衡棒實驗:采用兩個平行棒(直徑 1 cm,長115 cm,間距 2.5 cm),末端與平臺(15 cm×50 cm)相連接,記錄雙后肢位于平行杠上的時間,一側后肢掉下或者摔倒、搖擺等情況。記錄每分鐘每米的錯誤次數。用于評價實驗動物后肢的協調能力。

② 爬桿實驗:將小鼠放在棒的頂端,頭部向下,使小鼠自然向下爬行。分級標準如下:

0 級:一步步向下爬;

1 級:向下滑行;

2 級:不能抓住棒;

3 級:翻正反射消失。則是用于評價實驗動物協調性的實驗。

04
自發活動能力

① 曠場實驗:將實驗動物放入25 cm×25 cm×25 cm 的空箱,與曠場中央放入單只實驗動物,予自由活動 10 min。試驗后噴灑酒精消除味道,進行下一只動物的實驗。分析實驗動物在中央區域和周邊區域的活動距離和時間。用于評價實驗動物自發活動情況。

② 高架十字迷宮實驗:由兩條開臂和兩條閉臂組成,呈相互垂直“十”字形,實驗動物頭朝開臂,放入其中,予自由活動 5 min,分析小鼠進入開臂和閉臂的時間及次數。用于評價實驗動物對于新奇環境的焦慮反應。

③ Lat 實驗:為給予大鼠一個視覺空間注意目標,分別記錄大鼠穿越角落的頻數(自發活動水平),直立和斜搭在墻上的頻率(非選擇性注意的水平)。Lat 迷宮實驗在大鼠自發活動及非選擇性注意水平的評價中可靠性非常高,已經成為有關注意缺陷疾病的常用模型之一。

05
動物情志活動能力

由于動物的情緒體驗難以用語言表達,行為實驗是其主要的評價方法。實驗方法主要包括強迫游泳、懸尾、糖水偏愛、獲得性無助、高架十字迷宮、曠場、明暗箱實驗等

① 糖水攝取實驗:對大鼠進行 24 h 禁水后,在背景安靜的房間內給予大鼠 2 瓶水,分別為1% 蔗糖水和純水,稱重。2 h 后再次稱重,計算動物的糖水消耗率,糖水偏愛率 = 糖水消耗 / 總液體消耗 ×100%。通常用于動物情志活動的評價。

② 強迫游泳實驗:將單只小鼠放入水深為10 cm的燒杯中,燒杯 20 cm×14 cm。水溫(24±2)℃,觀察 6 min,計算后 4 min 中內小鼠強迫游泳時不動時間。多用于檢測實驗動物是否處于“絕望行為”狀態。動物在最初入水時,會表現出掙扎、逃脫及游動。當感受到為不可逃脫后,變回采取將頭部露出水面、肢體保持不動的漂浮狀態。保持不動的狀態被稱為“絕望行為”。常常用于對抑郁癥模型進行評價。

③ 懸吊實驗:安靜、避光下,將大鼠尾部根部 1/3 處固定于懸尾實驗架上,頭向下,分別觀察不動時間、掙扎次數。觀察 5 min。常作為抗抑郁藥初篩及抑郁癥模型行為學檢測的輔助評價指標。產后抑郁癥動物模型實驗:采用對受孕母鼠分組進行地塞米松(第 1 天起)、地塞米松(第 15 天起)、生理鹽水組,分別觀察產后母鼠對幼崽的關愛行為和自身積極與消極行為。

關愛行為:噙崽潛伏期、集窩時間、舔崽時間、筑巢時間、噙崽頻率。

積極行為:母鼠站立、大步走動、攀越、頂撞鼠籠。

消極行為:母鼠將頭部埋于身體下部,頻繁無方向無目的的翻動墊料,后頭、尾、爪不停騷動的總時間。用于評價母鼠對幼崽的關愛行為和自身積極與消極行為。

06
機體疼痛及反射能力

① 咬肌和顳肌機械性痛覺敏感性的測量實驗:動物安靜、放松下輕靠在測量者手心,測量點位于眼耳連線中點,向下 10 mm 為咬肌的測量點。采用從小到大標號的尼龍毛,給組織施加不同壓力。觀察動物有無縮頭、抬腿、避開、發出聲音等陽性反應。記錄反應次數和相對應的尼龍毛編標號。另有研究根據臨床接受正畸治療患者的疼痛程度主要影響進食量的實驗,采用記錄大鼠每天 24 h 的飲食量、飲水量、體重的方法對 OP(正畸性痛)進行疼痛的定量評價。

② 椎間盤源性下腰痛動物模型實驗:觀察術后,大鼠的 9 種不同行為學,靜止不動、微動、運動、靜止時抬足、微動時抬足、運動時抬足、清理皮毛、后腿站立、屈身,通常用于對動物腰痛疾病模型的評價。

③ 機械刺激縮足反射閾值實驗:采用 16 個強度不同的刺激,從小到大,分別刺激大鼠兩側足底中心位置,每個強度 10 次。將大鼠出現 5 次以上的縮足反應強度定為對機械刺激的反應閾值,能夠測量實驗動物對機械刺激的反應閾值。

④ 熱刺激反射縮足潛伏期實驗:采用熱刺激儀器,使大鼠的足底落在照射光圈內,直徑為 5 mm,記錄從開始照射至大鼠出現縮足逃避反射的時間,此即為熱刺激反應潛伏期。

⑤ 飲水抑制的耳鳴動物行為學模型實驗:采用部分剝奪飲水的動物放入有持續噪音的背景中,并把噪音的停止與給予電擊相結合,使動物意識到噪音停止是危險的,從而主動抑制添水。建立“噪音停止—添水動作減少”的條件反射。多用于評價實驗動物是否發生了耳鳴。

二、行為學評分方法
Racine 標準:對癲癇小鼠的發作進行分級。

0 級:無反應;

Ⅰ級:節律性嘴或者面部抽動;

Ⅱ級:點頭或者甩尾;

Ⅲ級:單肢抽動;

Ⅳ級:多肢抽動或者強直;

Ⅴ級:全面強直陣攣發作。

分別記錄小鼠發作的潛伏期、發作程度分級、輕度發作(Ⅰ ~ Ⅲ)次數、重度發作(Ⅳ ~ Ⅴ)次數。

Longa 評分法:常用于腦出血及腦梗死動物模型評價。

0 分:無神經損傷癥狀;

1 分:不能完全伸展手術對側前爪或后爪;

2 分:行走時,向手術對側轉圈;

3 分:行走時,向手術對側傾倒;

4 分:不能自發行走,意識喪失。

Bederson 評分:常用于腦出血及腦梗死動物模型評價。

0 分:無神經功能缺損;

1 分:前肢出現任何屈曲成分,不伴其他不正常;

2 分:側推抵抗力下降,伴前肢屈曲,無轉圈行為;

3 分:同 2 級行為,伴自發性旋轉。

肢體對稱實驗評分:將大鼠置于網中,網眼大小為 2.3 cm×2.3 cm,當大鼠在網格中行走時,計數在 2 min 內其前爪漏到網眼中的次數,即錯步數。

計算公式:(腦病變對側前爪的錯步數 - 病變同側前爪的錯步數)/ 總步數。其分值如為正數表明腦病變對側功能缺損,如為負數表明腦病變同側功能缺損。

暗盒實驗:對動物行為進行評分,良好 0~3分;一般:4~6 分;差:7~10 分。并觀察糞便的粒數。糞便粒數反應其緊張的程度。

行為學觀察包括:抓取時的反應、進入暗盒時的反應、進入暗盒后的反應、開暗盒時的反應、回飼養籠的反應。

小型豬腦缺血模型神經功能缺失評分:每頭實驗動物在術后 3 h、6 h、12 h、1~7 d 進行改良的神經功能缺失評分。總分為 25 分,包括食欲(4 分)、站姿(5 分)、頭部位置(2 分)、發聲(2 分)、步態(3 分)、運動功能(前肢 / 后肢,4×2 分)以及面癱(1 分)。

憤怒行為實驗,憤怒行為檢測:①搏斗次數;②威嚇次數;③攀壓次數;④勝利次數;⑤失敗次數。

行為學得分 = ① + ② + ③ + ④ - ⑤。是通過各項目相加所得總分,來評價動物憤怒模型的方法。

結語:

從實驗動物的飼養階段開始,便要通過動物行為來觀察實驗動物的健康情況,通過給藥、手術及其他干預措施制作動物模型,無論是制作西醫的疾病模型,還是中醫證候模型的復制,動物行為學始終貫穿于動物實驗的整體之中。對于動物學家來說,無論是基礎還是應用研究,正確的設計和執行都是實驗所必要的。

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